Szigorú szakmai szabályoknak megfelelően - az exogén DNS-sel történő szennyeződést megelőzendő - a pre- és post-PCR munkafázisok térben elszeparáltan történnek. A tiszta pre-PCR laboratóriumunkat célirányosan archaikus humán DNS-minták feldolgozására alakítottuk ki. A pre-PCR laboratórium teljes területén megfelelő védőruházatot kell viselni, amely munkatársaink esetében tiszta munkaruhát, szájmaszkot, hajhálót, lábzsákot és több réteg gumikesztyűt jelent.

Minden olyan eszközt, amely az archaikus mintákkal valamiféle fizikai kapcsolatba kerül, használat előtt és után nátrium-hipoklorittal és UV-C fénnyel dekontaminálunk, valamint előnyben részesítjük a gyárilag steril, egyszer-használatos termékek használatát. A post-PCR laboratórium két emelet távolságban helyezkedik el a pre-PCR laboratóriumtól. A kereszt-kontaminációt megelőzendő, a munkafolyamat illetve a mintakezelés szigorúan pre-PCR -> post-PCR irányba történik.

Stratégiai Kutatási Infrastruktúra (SKI)

A MTA BTK Régészeti Intézet Archaeogenetikai Laboratóriumának Stratégiai Kutatási Infrastruktúrája alkalmas erősen degradált DNS minták feldolgozására és szekvenálására (lásd Módszerek fejezet).
Válogatás a rendelkezésre álló műszerekből:

• Homokfúvásos fogtechnikai tisztítók
• Golyós őrlőmalom
• Lamináris fülkék, PCR fülkék
• PCR gépek, centrifugák, rotátorok
• Merck Millipore filteres vákuum DNS tisztító rendszer
• Real-time 7500 PCR készülék (Applied Biosystem)
• Illumina MiSeq szekvenátor
• Agilent TapeStation 4200 System
• Qubit fluorométer
• Vision Express géldokumentációs rendszer
• Beckmann Coulter Biomek i5 robotok

Együttműködési szándék esetén a részletekért kérjük forduljon laboratóriumunk vezetőjéhez!

A vizsgálataink elvégzéséhez elsősorban fogak és azok a csontok alkalmasak, amelyek nagyobb tömegű kortikális állománnyal rendelkeznek. Ez az állomány őrzi meg ugyanis számunkra az archaikus DNS-t a lehető legnagyobb mennyiségben és a lehető legjobb állapotban. Újabb kutatási eredmények szerint a koponya sziklacsonti része különösen magas arányban tartalmazza a szervezet saját DNS állományát.

A vizsgálati anyagok preferecia sorrendje a következőképpen alakul:

• elsősorban halántékcsont sziklacsonti része (pars petrosa ossis temporalis)
• másodsorban nagyobb intakt fogak (őrlőfogak)
• harmadsorban nagyobb kortikális állománnyal rendelkező csontok (pl. combcsont, sípcsont, felkarcsont).

A csontokban fennmaradó DNS állományt a hőmérséklet ingadozása, nedvesség, illetve egyéb tényezők (pl. savas kémhatás) roncsolják. A földből előkerülő történeti korú csontok felületén az azokat kezelő, feldolgozó személyek ujjlenyomatokat hagynak, melyek DNS nyomokat is tartalmaznak, jelentősen megnehezítve az ősi DNS kutatását. A múzeumi raktárokban tartott csontokban a DNS degradálódása jelentősen felgyorsulhat. A DNS mintavételt ezért célszerű a frissen kiásott (nem mosott) csontokon végezni, lehetőség szerint még az ásatáson, hogy a kontamináció esélyét minimálisra csökkentsük.

A vizsgálatra beérkező csontmintákat egyedi azonosítóval látjuk el, adataikat nyilvántartásba vesszük, majd fotót készítünk róluk. A csont elsődleges, fizikai tisztításához egy szeparált kabint építettünk, amelynek munkafelületeit, eszközeit nátrium-hipoklorittal és UV-C fénnyel sterilizáljuk a munkafázisok megkezdése előtt és azok után. Ebben a térben történik a csontdarab mechanikai tisztítása. A keletkező csontport a minél tisztább munkakörülmények és a kontamináció elkerülése érdekében egy nagyteljesítményű elszívóra szerelt mobil porszívó fej segítségével távolítjuk el a levegőből a munkavégzés közben. A fogminták felszínét homokcsiszolóval tisztítjuk meg. A megcsiszolt mintákat ismételt UV besugárzásnak tesszük ki, így távolítjuk el a felületükön lévő esetleges modern DNS szennyeződést.

A megtisztított mintát az erre a célra épített porító helyiségben leőröljük, golyós őrlő-malomban zúzzuk össze, vagy fogászati fúrógéppel fúrunk belőle csontport. Az így nyert port lemérjük, majd steril, zárható centrifugacsövekbe töltjük és a további feldolgozásig hűtő-szekrényben tároljuk. A persely belső felületéről rendszeresen ellenőrző mintákat veszünk és ezt kontrollként az összes további munkafázisban a mintával együtt (azzal párhuzamosan) kezeljük.

A DNS-izolálás lamináris fülke alatt, többféle módszerrel történhet, attól függően, hogy előzetesen milyennek ítéljük meg a csont állapotát (DNS-megtartóképességét), illetve, hogy milyen DNS vizsgálathoz izoláljuk a DNS-t. Az izolálási munkafolyamatot robotizáltuk, mely jelentősen megkönnyíti és gyorsítja a minták feldolgozását. A csontból kinyert DNS-t egyedi azonosítóval ellátva fagyasztószekrényben tároljuk. Minden sorozathoz külön izolációs negatív kontrollt alkalmazunk, amelyeket a továbbiakban szintén a mintával párhuzamosan kezelünk. Ez kizárólag a tisztítási eljárás során felhasznált oldatokat tartalmazza.

A DNS izolátumokból DNS könyvtárakat készítünk manuális, vagy robotra optimalizált módszerrel. A könyvtárkészítés során a DNS fragmenseket mintánként egyedi molekuláris azonosítókkal, bárkódokkal látjuk el, illetve kémiai úton javítjuk a DNS-ben postmortem bekövetkező változásokat. Ezután a DNS könyvtárakat amplifikáljuk, és előkészítjük az új-generációs szekvenálásra (NGS), melyet helyben Illumina MiSeq készüléken végzünk. Vizsgálati céljainktól függően a hibridizációs befogás (target capture) módszerével „kiválogatjuk” a számunkra érdekes DNS régiókat (teljes mitokondriális genom, egypontos nukleotid polimorfizmusok) a mintákból, vagy random „shutgun” szekvenálást végzünk.

Autoszomális DNS vizsgálat:

Az autoszomális DNS a sejtek sejtmagjában lévő testi vagy autoszomális kromoszómák DNS állománya. Markerei diploid formában vannak jelen, azaz anyai és apai eredetű, azonos alapszerkezetű párokat alkotnak, azonban egy-egy gén eltérő alléljait, változatait hordozhatják. Az autoszomális DNS vizsgálata többek között vér szerinti családi kapcsolatok meghatározására alkalmas. Minél több markert alkalmazunk, nagyobb szakaszokat vizsgálunk, annál nagyobb valószínűséggel mondhatjuk meg, hogy a vizsgált személyek közvetlen rokoni kapcsolatban álltak-e vagy sem. A testi kromoszómákból nyert információ alkalmas továbbá populációgenetikai események meghatározására, csoportok eredetének, múltbeli keveredéseinek feltárására és az egykor élt egyén külső jegyeinek, genetikai betegségeinek feltárására.

A sejtmagi DNS tipizálása Illumina platformra gyárilag, valamint helyben tervezett SNP-ket (egypontos nukleotid polimorfizmusokra) megcélzó hibiridizációs befogás (target capture) nevű módszerrel és random „shotgun” szekvenálással történik, ami lehetővé teszi a DNS könyvtárak nukleotid sorrendjének leolvasását.

Az eredményeket a nemzetközi laboratóriumok által is használt programokkal, bioinformatikai eszközökkel értékeljük ki. Link:  Software | David Reich Lab (harvard.edu).

Publikálás után a nyers és kiértékelt DNS eredmények elérhetővé válnak nemzetközi online adatbázisokban (ENA, NCBI) és a publikáció online mellékleteként. 

Y kromoszóma vizsgálata:

Az Y kromoszóma az emberi test sejtmagi DNS állományát alkotó kromoszómakészlet haploid tagja, amely csak apai ágon öröklődik. A nagy része (~24 megabázis hosszúságú szakasz) nem rekombinálódik az X kromoszómával, így ezen szakasz polimorfizmusainak vizsgálata az apai leszármazási vonalak követését teszi lehetővé. Laboratóriumunkban többféle módszerrel (STR, SNP tipizálás) vizsgáljuk az Y kromoszómákat, melyek segítségével apai leszármazási kapcsolatokat tudunk meghatározni.

Mitokondriális genom vizsgálata:

A mitokondrium egy sejtalkotó, ami az emberi test sejtjeinek energiaháztartásában játszik kiemelkedő szerepet, és önálló DNS-állománnyal rendelkezik. A mitokondriális DNS egy sejtben több száz, akár több ezer kópiában van jelen, és mivel öröklődése elsősorban anyai ágon történik, lehetővé teszi számunkra az anyai ági rokonság vizsgálatát. A mitokondriális DNS-ből kinyerhető eredmények populációgenetikai jelentőséggel bírnak. Laborunkban 2015-ig elsősorban a mitokondriális DNS kontroll régiójának I-es típusú hipervariábilis régióját (HVR-I) vizsgáltuk, az innen kapott eredményeket pedig a kódoló régió bizonyos pozícióinak (polimorfizmusainak) meghatározásával erősítettük meg. 2015-től fokozatosan áttértünk a teljes mitokondriális genom új típusú szekvenálására, Illumina MiSeq készüléken. A munkafolyamat során a DNS könyvtárak hibridizációs befogáson (target capture) alapuló mitokondriális genom dúsítási (enrichment) folyamaton mennek keresztül, mely módszert szintén optimalizáltunk a Biomek i5 robotokra, növelve ezzel a laboratórium mintafeldolgozó kapacitását.