Csontminta kifűrészelése.A vizsgálatra beérkező csontmintákat egyedi azonosítóval látjuk el, adataikat nyilvántartásba vesszük, majd fotót készítünk róluk. A csont elsődleges, fizikai tisztításához egy szeparált kabint építettünk, amelynek munkafelületeit, eszközeit nátrium-hipoklorittal és UV-C fénnyel sterilizáljuk a munkafázisok megkezdése előtt és azok után. Ebben a térben történik a csontdarab mechanikai tisztítása. A keletkező csontport a minél tisztább munkakörülmények és a kontamináció elkerülése érdekében egy nagyteljesítményű elszívóra szerelt mobil porszívó fej segítségével távolítjuk el a levegőből a munkavégzés közben. A fogminták felszínét homokcsiszolóval tisztítjuk meg. A megcsiszolt mintákat ismételt UV besugárzásnak tesszük ki, így távolítjuk el a felületükön lévő esetleges modern DNS szennyeződést.


SandblastingA megtisztított mintát az erre a célra épített porító helyiségben leőröljük, golyós őrlőmalomban zúzzuk össze, vagy fogászati fúrógéppel fúrunk belőle csontport. Az így nyert port lemérjük, majd steril, zárható centrifugacsövekbe töltjük és a további feldolgozásig hűtőszekrényben tároljuk. A persely belső felületéről rendszeresen ellenőrző mintákat veszünk és ezt kontrollként az összes további munkafázisban a mintával együtt (azzal párhuzamosan) kezeljük.

 

DNS-izolálásA DNS-izolálás lamináris fülke alatt, többféle módszerrel történhet, attól függően, hogy előzetesen milyennek ítéljük meg a csont állapotát (DNS-megtartóképességét), illetve, hogy milyen DNS vizsgálathoz izoláljuk a DNS-t. Az izolálási munkafolyamatot robotizáltuk, mely jelentősen megkönnyíti és gyorsítja a minták feldolgozását. A csontból kinyert DNS-t egyedi azonosítóval ellátva fagyasztószekrényben tároljuk. Minden sorozathoz külön izolációs negatív kontrollt alkalmazunk, amelyeket a továbbiakban szintén a mintával párhuzamosan kezelünk. Ez kizárólag a tisztítási eljárás során felhasznált oldatokat tartalmazza.

A DNS izolátumokból DNS könyvtárakat készítünk manuális, vagy robotra optimalizált módszerrel. A könyvtárkészítés során a DNS fragmenseket mintánként egyedi molekuláris azonosítókkal, bárkódokkal látjuk el, illetve kémiai úton javítjuk a DNS-ben postmortem bekövetkező változásokat. Ezután a DNS könyvtárakat amplifikáljuk, és előkészítjük az új-generációs szekvenálásra (NGS), melyet helyben Illumina MiSeq készüléken végzünk. Vizsgálati céljainktól függően a hibridizációs befogás (target capture) módszerével „kiválogatjuk” a számunkra érdekes DNS régiókat (teljes mitokondriális genom, egypontos nukleotid polimorfizmusok) a mintákból, vagy random „shutgun” szekvenálást végzünk.

 

Autoszomális DNS vizsgálat:

Post-PCR labor.

Az autoszomális DNS a sejtek sejtmagjában lévő testi vagy autoszomális kromoszómák DNS állománya. Markerei diploid formában vannak jelen, azaz anyai és apai eredetű, azonos alapszerkezetű párokat alkotnak, azonban egy-egy gén eltérő alléljait, változatait hordozhatják. Az autoszomális DNS vizsgálata többek között vér szerinti családi kapcsolatok meghatározására alkalmas. Minél több markert alkalmazunk, nagyobb szakaszokat vizsgálunk, annál nagyobb valószínűséggel mondhatjuk meg, hogy a vizsgált személyek közvetlen rokoni kapcsolatban álltak-e vagy sem. A testi kromoszómákból nyert információ alkalmas továbbá populációgenetikai események meghatározására, csoportok eredetének, múltbeli keveredéseinek feltárására és az egykor élt egyén külső jegyeinek, genetikai betegségeinek feltárására.

A sejtmagi DNS tipizálása Illumia platformra gyárilag, valamint helyben tervezett SNP-ket (egypontos nukleotid polimorfizmusokra) megcélzó hibiridizációs befogás (target capture) nevű módszerrel és random „shotgun” szekvenálással történik, ami lehetővé teszi a DNS könyvtárak nukleotid sorrendjének leolvasását.

Az eredményeket a nemzetközi laboratóriumok által is használt programokkal, bioinformatikai eszközökkel értékeljük ki. Link:  Software | David Reich Lab (harvard.edu).

Publikálás után a nyers és kiértékelt DNS eredmények elérhetővé válnak nemzetközi online adatbázisokban (ENA, NCBI) és a publikáció online mellékleteként. 

 

Y kromoszóma vizsgálata:

PCRAz Y kromoszóma az emberi test sejtmagi DNS állományát alkotó kromoszómakészlet haploid tagja, amely csak apai ágon öröklődik. A nagy része (~24 megabázis hosszúságú szakasz) nem rekombinálódik az X kromoszómával, így ezen szakasz polimorfizmusainak vizsgálata az apai leszármazási vonalak követését teszi lehetővé. Laboratóriumunkban többféle módszerrel (STR, SNP tipizálás) vizsgáljuk az Y kromoszómákat, melyek segítségével apai leszármazási kapcsolatokat tudunk meghatározni.

 

Mitokondriális genom vizsgálata:

i5 robotA mitokondrium egy sejtalkotó, ami az emberi test sejtjeinek energiaháztartásában játszik kiemelkedő szerepet, és önálló DNS-állománnyal rendelkezik. A mitokondriális DNS egy sejtben több száz, akár több ezer kópiában van jelen, és mivel öröklődése elsősorban anyai ágon történik, lehetővé teszi számunkra az anyai ági rokonság vizsgálatát. A mitokondriális DNS-ből kinyerhető eredmények populációgenetikai jelentőséggel bírnak. Laborunkban 2015-ig elsősorban a mitokondriális DNS kontroll régiójának I-es típusú hipervariábilis régióját (HVR-I) vizsgáltuk, az innen kapott eredményeket pedig a kódoló régió bizonyos pozícióinak (polimorfizmusainak) meghatározásával erősítettük meg. 2015-től fokozatosan áttértünk a teljes mitokondriális genom új típusú szekvenálására, Illumina MiSeq készüléken. A munkafolyamat során a DNS könyvtárak hibridizációs befogáson (target capture) alapuló mitokondriális genom dúsítási (enrichment) folyamaton mennek keresztül, melymódszert szintén optimalizáltunk a Biomek i5 robotokra, növelve ezzel a laboratórium mintafeldolgozó kapacitását.